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HPLC法测定盐酸缬更昔洛韦中间体缩合物异构体的含量
- 分类：学术园地
- 发布时间：2020-05-19 11:12
【概要描述】HPLC法测定盐酸缬更昔洛韦中间体缩合物异构体的含量刘俊，柳旭，邓亚萍，余再丹，黄琨 （湖北丽益医药科技有限公司抗病毒湖北重点实验室武汉430205）摘要目的：采用HPLC法测定盐酸缬更昔洛韦的关键中间体缩合物的非对映体比例和对映体含量，以对其质量进行控制。方法：色谱柱为CHIRALCEl®OX-3R，流动相为水-乙腈（65:35），流速为0.6ml·min-1，柱温为17℃，检测波长为252nm，进样量为10μl。结果：缩合物线性范围为0.23~626.38μg·ml-1（r=0.9999），缩合物异构体线性范围为0.24~13.06μg·ml-1（r=0.9999）；平均回收率为99.2%，RSD为2.08%（n=9）。结论：该方法操作简便，灵敏度高，结果准确可靠，可作为缩合物质量控制的方法。关键词盐酸缬更昔洛韦；缩合物；异构体；高效液相色谱法 DeterminationofIsomersofValganciclovirHydrochlorideIntermediateCondensatebyHPLCLiuJun，LiuXu，DengYaping，YuZaidan，HuangKun（ChinaMehecoLiyiPharmSci&TechCO.,LTD.，HubeiKeyLaboratoryofAntiviralDrugs，Wuhan430205，China）ABSTRACTObjective：TodeterminetheenantiomerratioandenantiomercontentofkeyintermediatecondensatesofvalganciclovirhydrochloridebyHPLCtocontrolitsquality.Methods:ThedeterminationwasperformedonDaicelCHIRALCEl®OX-3R(150mm×4.6mm,3μm)columnwiththemobilephaseconsistedofwater-acetonitrile(65:35)attheflowrateof0.6ml·min-1.Thecolumntemperaturewas17℃,thedetectionwavelengthwassetat252nm,andthesamplesizewas10μl.Results:Therewasagoodlinearrelationshipoftheenantiomerproductrangedfrom0.24to13.06μg·ml-1(r=0.9999)andthatofisomerwasfrom0.23to626.38μg·ml-1(r=0.9999).Theaveragerecoverywas99.2%(RSD=2.08%,n=9).Conclusion:Themethodisconvenient,sensitiveandaccurate,andsuitablefordeterminationoftheCondensationproduct.KEYWORDSValganciclovirhydrochloride;Condensationproduct;Isomer;HPLC 盐酸缬更昔洛韦是一种疱疹病毒DNA的合成抑制剂，是由瑞士Roche公司研发的口服抗巨细胞病毒（CMV）感染药物[1]。2001年3月获准美国FDA许可，2001年5月首次在美国上市销售，临床用于治疗获得性免疫缺陷综合症（AIDS）患者因感染CMV所致急性视网膜炎[2]。2003年5月扩大了其适应症，用于预防和治疗器官移植者继发CMV感染[3,4]。国内外的多项研究显示，盐酸缬更昔洛韦片药理作用明显，作用机制较新颖，毒性低，不良反应少，临床疗效显著，患者顺应性高，应用安全。中间体缩合物是盐酸缬更昔洛韦合成过程中的关键中间体，含有两个手性中心，L型缩合物为目标中间体，由两个非对映体组成，D型缩合物为对映体杂质。缩合物的生成是手性中心生成的步骤，属于质量控制的关键步骤，缩合物经过水解、氢化、成盐后即可得到盐酸缬更昔洛韦。对于盐酸缬更昔洛韦，目前美国药典中规定其非对映异构体比例范围为45:55~55:45，其对映体杂质的含量不得超过3.0%[6]，所以在合成过程中，开发具有专属性的方法[7]来检测中间体缩合物四种异构体构型的纯度，并制定合理可行的非对映异构体比例范围和对映体杂质限度，是中间体缩合物质量控制的重要部分，也是保证盐酸缬更昔洛韦及其制剂产品质量的重要部分。 表1缩合物及其对映异构体结构式 1仪器与试药1.1仪器安捷伦1260高效液相色谱仪；Chromeleon7工作站；岛津AUW120D分析天平。 1.2试药D-缩合物对照品（对映体杂质，批号：170714，纯度：99.2%）、L-缩合物对照品（目标中间体，批号：171221，纯度：99.0%）、L-缩合物供试品（批号：180228-07、180409-02、180509-03）均为实验室自制。乙腈为色谱纯，实验用水为注射用水。2方法与结果2.1色谱条件 色谱柱：CHIRALCEl®OX-3R（150mm×4.6mm，3μm）；流动相：水-乙腈（65:35）；流速：0.6ml·min-1；检测波长：252nm；柱温：17℃；进样量：10μl。2.2溶液的制备2.2.1D-缩合物对照品溶液取D-缩合物对照品约10mg，精密称定，置50ml量瓶中，用水-乙腈（50:50）溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品贮备液。精密量取1ml置25ml量瓶，用水-乙腈（50:50）稀释至刻度，摇匀，即得。2.2.2供试品溶液取L-缩合物约10mg，精密称定，置25ml量瓶中，用水-乙腈（50:50）溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。2.2.3系统适用性溶液取L-缩合物对照品约10mg，精密称定，置于25ml量瓶中，再向量瓶中精密加入D-缩合物对照品贮备液1ml，用水-乙腈（50:50）溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。2.3测定方法 精密量取系统适用性溶液、供试品溶液各10μl注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍。以峰面积归一化法计算缩合物中非对映体的比例和异构体杂质的含量，其中非对映体的比例应在48:52~52:48范围内，异构体杂质的含量不得过2.0%。2.4专属性考察分别取空白溶剂[水-乙腈（50:50）]、对照品溶液、供试品溶液和系统适用性溶液，按照“2.1”项色谱条件进样，记录色谱图，结果见图1。A A.空白溶剂B.对照品溶液C.系统适用性溶液D.供试品溶液1和4为L-缩合物2和3为D-缩合物图1 HPLC色谱图2.5线性关系考察精密量取D-缩合物对照品贮备液4ml置50ml量瓶，用水-乙腈（50:50）稀释至刻度，得到4%线性贮备液；精密量取4%线性贮备液1、3、5、8ml，分别置四个10ml量瓶，用水-乙腈（50:50）稀释至刻度，得到0.4%、1.2%、2.0%、3.2%系列线性溶液；精密量取2%线性溶液3ml分别置100ml量瓶，用水-乙腈（50:50）稀释至刻度，得到0.06%线性溶液；按照上述色谱条件进样，记录色谱图，以浓度（C，μg·ml-1）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标进行线性回归，回归方程为：A=28.09C+0.128（r=0.9999）。实验表明，对照品溶液在0.24~13.06μg·ml-1浓度范围内，与峰面积呈良好的线性关系。精密称取L-缩合物对照品约40mg，置50ml量瓶中，用水-乙腈（50:50）溶解并稀释至刻度，作为线性贮备液；精密量取线性贮备液1、3、5、8ml置4个10ml量瓶，用水-乙腈（50:50）稀释至刻度，得到20%、60%、100%、160%线性溶液；精密量取线性贮备液1ml置20ml量瓶，用水-乙腈（50:50）稀释至刻度，得到10%线性溶液；精密量取10%线性溶液1ml、2ml置两个10ml量瓶，用水-乙腈（50:50）稀释至刻度，得到1%、2%线性溶液；精密量取1%线性溶液3ml置50ml量瓶，用水-乙腈（50:50）稀释至刻度，得到0.06%线性溶液；按照上述色谱条件进样，记录色谱图，以浓度（C，μg·ml-1）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标进行线性回归，回归方程为：A=27.32C+32.51（r=0.9999）。实验表明，对照品溶液在0.23~626.38μg·ml-1浓度范围内，与峰面积呈良好的线性关系；同时由于L-缩合物和D-缩合物线性方程斜率大小相当，响应因子基本一致，支持采用峰面积归一化法计算。2.6检测限与定量限考察取“2.2.2”项下D-缩合物对照品贮备液并适当稀释，按照上述色谱条件进样分析，记录色谱图。当信噪比为3:1时，得检测限；当信噪比为10:1时，得定量限。结果，D-缩合物的检测限为7.2×10-4μg，定量限为2.4×10-3μg。取“2.5”项下L-缩合物对照品线性贮备液并适当稀释，按照上述色谱条件进样分析，记录色谱图。当信噪比为3:1时，得检测限；当信噪比为10:1时，得定量限。结果，L-缩合物的检测限为6.9×10-4μg，定量限为2.3×10-3μg。2.7精密度试验2.7.1进样精密度取系统适用性溶液，按照上述色谱条件，重复进样6次，D-缩合物的峰面积的RSD为2.89%（n=6），L-缩合物的峰面积的RSD为0.42%（n=6），表明进样精密度良好。2.7.2中间精密度试验对批号为180228-07的样品不同日期、不同操作人员、不同仪器条件下，按照上述色谱条件，进行中间精密度试验，测定结果的RSD为1.93%（n=12），表明中间精密度试验良好。2.8重复性试验 取批号为180228-07的样品依法制备6份供试品溶液，按照上述色谱条件测定异构体的含量，测定结果的平均值为1.69%，RSD为1.58%（n=6），表明重复性试验良好。2.9溶液稳定性试验取系统适用性溶液，分别在0、2、4、6、8h，按照上述色谱条件进行测定，D-缩合物的峰面积的RSD为2.72%（n=5），L-缩合物的峰面积的RSD为1.36%（n=5）。说明溶液在8小时内稳定性良好。2.10回收率试验取批号为180228-07的样品约10mg（共9份），精密称定，分别置于25ml量瓶中，分别精密加入D-缩合物对照品贮备液0.8、0.8、0.8、1.0、1.0、1.0、1.2、1.2、1.2ml，用水-乙腈（50:50）溶解并稀释至刻度，按照上述色谱条件测定，结果加样回收率在95%~105%之间，回收率平均值为99.2%，RSD为2.08%（n=9）。2.11缩合物样品中非对映体的比例及异构体含量的测定取本品3批，按照上述色谱条件测定，结果批号180228-07、180409-02、180509-03的样品中非对映体比例分别为49.8：50.2、49.2：50.8、49.5：50.5，异构体含量分别为1.74%、0.86%、1.06%，测定结果稳定，表明本检测方法可行。3讨论在筛选试验条件时，发现柱温对分离度影响较大，考察了15、17、20℃不同柱温时L-缩合物与D-缩合物各峰之间的分离度，结果柱温较低时分离度更好，考虑到仪器的匹配性方面，柱温采用17℃。考察了流动相比例的耐用性，水-乙腈（70:30、65:35、60:40），L-缩合物与D-缩合物各峰之间的分离度，三种不同比例下均能够有效分离，最终流动相采用水-乙腈（65:35）。综上，本方法实现了对盐酸缬更昔洛韦中间体缩合物4种异构体的有效分离和检测，因此本方法能够更好地实现对中间体缩合物的异构体的控制，从源头控制成品盐酸缬更昔洛韦及其制剂的质量，提高最终产品的品质，保证了其临床用药的安全有效。本方法操作简便、灵敏度高、准确、重复性好，分析时间短，为产品的研发和生产提供了简便、稳定、可靠的分析检测方法。 参考文献[1]赵士魁，马康，郭庆明，等.盐酸缬更昔洛韦的合成[J].中国医药工业杂志，2015，46(2)：120-122.[2]钟倩.嘌呤类核苷类—抗病毒药缬更昔洛韦[J].世
HPLC法测定盐酸缬更昔洛韦中间体缩合物异构体的含量
【概要描述】HPLC法测定盐酸缬更昔洛韦中间体缩合物异构体的含量刘俊，柳旭，邓亚萍，余再丹，黄琨 （湖北丽益医药科技有限公司抗病毒湖北重点实验室武汉430205）摘要目的：采用HPLC法测定盐酸缬更昔洛韦的关键中间体缩合物的非对映体比例和对映体含量，以对其质量进行控制。方法：色谱柱为CHIRALCEl®OX-3R，流动相为水-乙腈（65:35），流速为0.6ml·min-1，柱温为17℃，检测波长为252nm，进样量为10μl。结果：缩合物线性范围为0.23~626.38μg·ml-1（r=0.9999），缩合物异构体线性范围为0.24~13.06μg·ml-1（r=0.9999）；平均回收率为99.2%，RSD为2.08%（n=9）。结论：该方法操作简便，灵敏度高，结果准确可靠，可作为缩合物质量控制的方法。关键词盐酸缬更昔洛韦；缩合物；异构体；高效液相色谱法 DeterminationofIsomersofValganciclovirHydrochlorideIntermediateCondensatebyHPLCLiuJun，LiuXu，DengYaping，YuZaidan，HuangKun（ChinaMehecoLiyiPharmSci&TechCO.,LTD.，HubeiKeyLaboratoryofAntiviralDrugs，Wuhan430205，China）ABSTRACTObjective：TodeterminetheenantiomerratioandenantiomercontentofkeyintermediatecondensatesofvalganciclovirhydrochloridebyHPLCtocontrolitsquality.Methods:ThedeterminationwasperformedonDaicelCHIRALCEl®OX-3R(150mm×4.6mm,3μm)columnwiththemobilephaseconsistedofwater-acetonitrile(65:35)attheflowrateof0.6ml·min-1.Thecolumntemperaturewas17℃,thedetectionwavelengthwassetat252nm,andthesamplesizewas10μl.Results:Therewasagoodlinearrelationshipoftheenantiomerproductrangedfrom0.24to13.06μg·ml-1(r=0.9999)andthatofisomerwasfrom0.23to626.38μg·ml-1(r=0.9999).Theaveragerecoverywas99.2%(RSD=2.08%,n=9).Conclusion:Themethodisconvenient,sensitiveandaccurate,andsuitablefordeterminationoftheCondensationproduct.KEYWORDSValganciclovirhydrochloride;Condensationproduct;Isomer;HPLC 盐酸缬更昔洛韦是一种疱疹病毒DNA的合成抑制剂，是由瑞士Roche公司研发的口服抗巨细胞病毒（CMV）感染药物[1]。2001年3月获准美国FDA许可，2001年5月首次在美国上市销售，临床用于治疗获得性免疫缺陷综合症（AIDS）患者因感染CMV所致急性视网膜炎[2]。2003年5月扩大了其适应症，用于预防和治疗器官移植者继发CMV感染[3,4]。国内外的多项研究显示，盐酸缬更昔洛韦片药理作用明显，作用机制较新颖，毒性低，不良反应少，临床疗效显著，患者顺应性高，应用安全。中间体缩合物是盐酸缬更昔洛韦合成过程中的关键中间体，含有两个手性中心，L型缩合物为目标中间体，由两个非对映体组成，D型缩合物为对映体杂质。缩合物的生成是手性中心生成的步骤，属于质量控制的关键步骤，缩合物经过水解、氢化、成盐后即可得到盐酸缬更昔洛韦。对于盐酸缬更昔洛韦，目前美国药典中规定其非对映异构体比例范围为45:55~55:45，其对映体杂质的含量不得超过3.0%[6]，所以在合成过程中，开发具有专属性的方法[7]来检测中间体缩合物四种异构体构型的纯度，并制定合理可行的非对映异构体比例范围和对映体杂质限度，是中间体缩合物质量控制的重要部分，也是保证盐酸缬更昔洛韦及其制剂产品质量的重要部分。 表1缩合物及其对映异构体结构式 1仪器与试药1.1仪器安捷伦1260高效液相色谱仪；Chromeleon7工作站；岛津AUW120D分析天平。 1.2试药D-缩合物对照品（对映体杂质，批号：170714，纯度：99.2%）、L-缩合物对照品（目标中间体，批号：171221，纯度：99.0%）、L-缩合物供试品（批号：180228-07、180409-02、180509-03）均为实验室自制。乙腈为色谱纯，实验用水为注射用水。2方法与结果2.1色谱条件 色谱柱：CHIRALCEl®OX-3R（150mm×4.6mm，3μm）；流动相：水-乙腈（65:35）；流速：0.6ml·min-1；检测波长：252nm；柱温：17℃；进样量：10μl。2.2溶液的制备2.2.1D-缩合物对照品溶液取D-缩合物对照品约10mg，精密称定，置50ml量瓶中，用水-乙腈（50:50）溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品贮备液。精密量取1ml置25ml量瓶，用水-乙腈（50:50）稀释至刻度，摇匀，即得。2.2.2供试品溶液取L-缩合物约10mg，精密称定，置25ml量瓶中，用水-乙腈（50:50）溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。2.2.3系统适用性溶液取L-缩合物对照品约10mg，精密称定，置于25ml量瓶中，再向量瓶中精密加入D-缩合物对照品贮备液1ml，用水-乙腈（50:50）溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。2.3测定方法 精密量取系统适用性溶液、供试品溶液各10μl注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍。以峰面积归一化法计算缩合物中非对映体的比例和异构体杂质的含量，其中非对映体的比例应在48:52~52:48范围内，异构体杂质的含量不得过2.0%。2.4专属性考察分别取空白溶剂[水-乙腈（50:50）]、对照品溶液、供试品溶液和系统适用性溶液，按照“2.1”项色谱条件进样，记录色谱图，结果见图1。A A.空白溶剂B.对照品溶液C.系统适用性溶液D.供试品溶液1和4为L-缩合物2和3为D-缩合物图1 HPLC色谱图2.5线性关系考察精密量取D-缩合物对照品贮备液4ml置50ml量瓶，用水-乙腈（50:50）稀释至刻度，得到4%线性贮备液；精密量取4%线性贮备液1、3、5、8ml，分别置四个10ml量瓶，用水-乙腈（50:50）稀释至刻度，得到0.4%、1.2%、2.0%、3.2%系列线性溶液；精密量取2%线性溶液3ml分别置100ml量瓶，用水-乙腈（50:50）稀释至刻度，得到0.06%线性溶液；按照上述色谱条件进样，记录色谱图，以浓度（C，μg·ml-1）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标进行线性回归，回归方程为：A=28.09C+0.128（r=0.9999）。实验表明，对照品溶液在0.24~13.06μg·ml-1浓度范围内，与峰面积呈良好的线性关系。精密称取L-缩合物对照品约40mg，置50ml量瓶中，用水-乙腈（50:50）溶解并稀释至刻度，作为线性贮备液；精密量取线性贮备液1、3、5、8ml置4个10ml量瓶，用水-乙腈（50:50）稀释至刻度，得到20%、60%、100%、160%线性溶液；精密量取线性贮备液1ml置20ml量瓶，用水-乙腈（50:50）稀释至刻度，得到10%线性溶液；精密量取10%线性溶液1ml、2ml置两个10ml量瓶，用水-乙腈（50:50）稀释至刻度，得到1%、2%线性溶液；精密量取1%线性溶液3ml置50ml量瓶，用水-乙腈（50:50）稀释至刻度，得到0.06%线性溶液；按照上述色谱条件进样，记录色谱图，以浓度（C，μg·ml-1）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标进行线性回归，回归方程为：A=27.32C+32.51（r=0.9999）。实验表明，对照品溶液在0.23~626.38μg·ml-1浓度范围内，与峰面积呈良好的线性关系；同时由于L-缩合物和D-缩合物线性方程斜率大小相当，响应因子基本一致，支持采用峰面积归一化法计算。2.6检测限与定量限考察取“2.2.2”项下D-缩合物对照品贮备液并适当稀释，按照上述色谱条件进样分析，记录色谱图。当信噪比为3:1时，得检测限；当信噪比为10:1时，得定量限。结果，D-缩合物的检测限为7.2×10-4μg，定量限为2.4×10-3μg。取“2.5”项下L-缩合物对照品线性贮备液并适当稀释，按照上述色谱条件进样分析，记录色谱图。当信噪比为3:1时，得检测限；当信噪比为10:1时，得定量限。结果，L-缩合物的检测限为6.9×10-4μg，定量限为2.3×10-3μg。2.7精密度试验2.7.1进样精密度取系统适用性溶液，按照上述色谱条件，重复进样6次，D-缩合物的峰面积的RSD为2.89%（n=6），L-缩合物的峰面积的RSD为0.42%（n=6），表明进样精密度良好。2.7.2中间精密度试验对批号为180228-07的样品不同日期、不同操作人员、不同仪器条件下，按照上述色谱条件，进行中间精密度试验，测定结果的RSD为1.93%（n=12），表明中间精密度试验良好。2.8重复性试验 取批号为180228-07的样品依法制备6份供试品溶液，按照上述色谱条件测定异构体的含量，测定结果的平均值为1.69%，RSD为1.58%（n=6），表明重复性试验良好。2.9溶液稳定性试验取系统适用性溶液，分别在0、2、4、6、8h，按照上述色谱条件进行测定，D-缩合物的峰面积的RSD为2.72%（n=5），L-缩合物的峰面积的RSD为1.36%（n=5）。说明溶液在8小时内稳定性良好。2.10回收率试验取批号为180228-07的样品约10mg（共9份），精密称定，分别置于25ml量瓶中，分别精密加入D-缩合物对照品贮备液0.8、0.8、0.8、1.0、1.0、1.0、1.2、1.2、1.2ml，用水-乙腈（50:50）溶解并稀释至刻度，按照上述色谱条件测定，结果加样回收率在95%~105%之间，回收率平均值为99.2%，RSD为2.08%（n=9）。2.11缩合物样品中非对映体的比例及异构体含量的测定取本品3批，按照上述色谱条件测定，结果批号180228-07、180409-02、180509-03的样品中非对映体比例分别为49.8：50.2、49.2：50.8、49.5：50.5，异构体含量分别为1.74%、0.86%、1.06%，测定结果稳定，表明本检测方法可行。3讨论在筛选试验条件时，发现柱温对分离度影响较大，考察了15、17、20℃不同柱温时L-缩合物与D-缩合物各峰之间的分离度，结果柱温较低时分离度更好，考虑到仪器的匹配性方面，柱温采用17℃。考察了流动相比例的耐用性，水-乙腈（70:30、65:35、60:40），L-缩合物与D-缩合物各峰之间的分离度，三种不同比例下均能够有效分离，最终流动相采用水-乙腈（65:35）。综上，本方法实现了对盐酸缬更昔洛韦中间体缩合物4种异构体的有效分离和检测，因此本方法能够更好地实现对中间体缩合物的异构体的控制，从源头控制成品盐酸缬更昔洛韦及其制剂的质量，提高最终产品的品质，保证了其临床用药的安全有效。本方法操作简便、灵敏度高、准确、重复性好，分析时间短，为产品的研发和生产提供了简便、稳定、可靠的分析检测方法。 参考文献[1]赵士魁，马康，郭庆明，等.盐酸缬更昔洛韦的合成[J].中国医药工业杂志，2015，46(2)：120-122.[2]钟倩.嘌呤类核苷类—抗病毒药缬更昔洛韦[J].世
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